PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, al igual que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.^[1]​ en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia, tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación, y es por esto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). En muchos casos, el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es ADN desde el principio, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada «PCR tras transcripción inversa» (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.

La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien no con tanta precisión, también permiten su abordaje.^[2]​ La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a errores en la estimación deriva de la integridad del ADN, la eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado «normalizador», que se selecciona por su expresión casi constante. Estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes, ya que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresión constitutiva.^[3]​^[4]​ De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican las siguientes proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, ARN ribosomales, etc.^[2]​

1. ↑ Watson, J. D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. y Losick, R. (2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edición). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3. 
2. ↑ ^{a b} Pfaff, Michael W., Ales Tichopad, Christian Prgomet y Tanja P. Neuvians (2005). «Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations.» Archivado el 13 de septiembre de 2019 en Wayback Machine. Biotechonology Letters 26:509-515.
3. ↑ Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe, A., Speleman, F. (2002) «Accurate normalisation of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.» Archivado el 27 de mayo de 2020 en Wayback Machine. Gen. Biol. 3: 1-12.
4. ↑ Pfaffl, M. W., Horgan, G. W., Dempfle, L. (2002) «Relative Expression Software Tool (REST©) for group wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR.» Nucl. Acids Res. 30: e36.