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Clonaggio, con riferimento a frammenti di DNA, è un insieme di metodi sperimentali nella biologia molecolare che descrive l'assemblaggio di molecole ricombinanti e, dunque, una serie di tecniche con le quali è possibile ottenere più copie di una determinata sequenza nucleotidica, non necessariamente di natura genica.
L'uso del termine clonaggio si riferisce al fatto che il metodo includa la replicazione di una molecola per produrre una colonia di cellule con le stesse molecole di DNA.
Esistono essenzialmente due tecnologie di clonaggio: la prima, anche in ordine temporale (risale agli anni settanta), utilizza per il clonaggio del DNA gli enzimi di restrizione e vettori di clonaggio. Il frammento d'interesse deve essere isolato con enzimi di restrizione e quindi inserito in un vettore (tipicamente un plasmide) mediante reazione di ligasi. Il vettore così ottenuto viene inserito nella cellula ospite, che viene coltivata in terreni selettivi.
Un secondo tipo di clonaggio, oggi ampiamente più usato e che ha rivoluzionato la biologia molecolare, è divenuto possibile nel 1985 con la messa a punto della reazione a catena della polimerasi o PCR. In breve, questa tecnica sfrutta la reazione catalizzata in vivo dall'enzima DNA polimerasi, durante la duplicazione semiconservativa del DNA, per realizzare clonaggi in vitro di qualsiasi frammento, di opportuna lunghezza, localizzato tra due brevi sequenze nucleotidiche dette primers.