Hydroxylering is iedere biochemische reactie waarbij een hydroxylgroep (OH) wordt toegevoegd aan een molecuul, meestal onder vervanging van een ander atoom zoals waterstof waarbij het zuurstofatoom van de hydroxy-groep de plaats van het vervangen atoom inneemt. Het is een vorm van oxidatie. Hydroxylering is een van de belangrijkste en meest voorkomende reacties in de biochemie van de levende wezens waaronder ook de mens. De biochemische hydroxylering wordt meestal door specifieke enzymen, zogenaamde hydroxylases, uitgevoerd waarbij meestal ascorbinezuur (vitamine C) als noodzakelijke co-factor optreedt. Over het algemeen (biochemisch) wordt de hydroxy-groep aan een koolstofatoom gebonden en vervangt deze een waterstofatoom.